SeekSoul Tools v1.2.2

作者: SeekGene

时长: 30 分钟

字数: 7.7k 字

更新: 2025-07-25

阅读: 0 次

SeekSoulTools 是寻因生物开发的一套处理单细胞转录组数据的软件，目前该软件包含四个模块:

1.rna模块；用于识别细胞标签barcode，比对定量，得到可用于下游分析的细胞表达矩阵，之后进行细胞聚类和差异分析，该模块不仅支持SeekOne®系列试剂盒产出数据，还可通过对barcode的描述，支持多种自定义设计结构；

2.fast模块：该模块专门针对SeekOne® DD单细胞全序列转录组试剂盒产出的数据，用于对数据进行barcode提取，双端reads比对，定量，以及全序列数据特有的指标统计。

3.vdj模块：该模块用于专门针对SeekOne® DD单细胞免疫分析试剂盒产出的数据，用于组装、过滤和注释免疫受体；

4.utils模块：该模块包含其他小工具。

软件下载

SeekSoul Tools v1.2.2

Download-SeekSoulTools - md5: af52b5d936b60c740b239301f2026aba

wget下载方式

shell

mkdir seeksoultools.1.2.2
cd seeksoultools.1.2.2
wget -c -O seeksoultools.1.2.2.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/seeksoultools/seeksoultools.1.2.2.tar.gz"

curl下载方式

shell

mkdir seeksoultools.1.2.2
cd seeksoultools.1.2.2
curl -C - -o seeksoultools.1.2.2.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/seeksoultools/seeksoultools.1.2.2.tar.gz"

软件安装

IMPORTANT

安装前请确保已正确配置conda环境，避免与其他生信软件环境冲突。

安装：

shell

# 解压
tar zxf seeksoultools.1.2.2.tar.gz

# 设置环境变量
export PATH=`pwd`:$PATH
echo "export PATH=$(pwd):\$PATH" >> ~/.bashrc

# 初始化和安装验证，初次执行所需时间稍长
./seeksoultools --version

TIP

建议将PATH添加到~/.bashrc，便于后续命令行直接调用。

NOTE

若出现"command not found"或依赖报错，请检查conda环境激活及PATH设置。

使用说明

rna模块

数据准备

测试数据下载

测试数据 - md5: 3d15fcfdefc0722735d726f40ec4e324（物种：人）

wget下载方式

shell

wget -c -O demo_dd.tar "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/demodata/demo_dd.tar"
# decompress
tar xf demo_dd.tar

curl下载方式

shell

curl -C - -o demo_dd.tar "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/demodata/demo_dd.tar"
# decompress
tar xf demo_dd.tar

参考基因组下载和构建

Download-human-reference-GRCh38 - md5: 5473213ae62ebf35326a85c8fba6cc42

Download-mouse-reference-mm10 - md5: 5c7c63701ffd7bb5e6b2b9c2b650e3c2

wget下载方式

shell

wget -c -O GRCh38.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/reference/GRCh38.tar.gz"
# decompress
tar -zxvf GRCh38.tar.gz
wget -c -O mm10.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/reference/mm10_ensemble_102.tar.gz"

tar -zxvf mm10.tar.gz

curl下载方式

shell

curl -C - -o GRCh38.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/reference/GRCh38.tar.gz"
# decompress
tar -zxvf GRCh38.tar.gz

curl -C - -o mm10.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/reference/mm10_ensemble_102.tar.gz"

tar -zxvf mm10.tar.gz

参考基因组的构建可以参考如何构建参考基因组？

CAUTION

下载和解压参考基因组时，请确保磁盘空间充足，避免文件损坏导致后续分析失败。

运行

运行示例

示例1：基本用法

为分析设置必要的配置文件，包括样本数据的路径、试剂类型、基因组索引、GTF等。使用以下命令运行SeekSoulTools：

shell

seeksoultools rna run \
--fq1 /path/to/demo_dd/demo_dd_S39_L001_R1_001.fastq.gz \
--fq2 /path/to/demo_dd/demo_dd_S39_L001_R2_001.fastq.gz \
--samplename demo_dd \
--genomeDir /path/to/GRCh38/star \
--gtf /path/to/GRCh38/genes/genes.gtf \
--chemistry DDV2 \
--core 4 \
--include-introns

示例2：指定其他版本STAR进行分析

为了在分析中使用特定版本的STAR，并确保与该版本生成的–genomeDir兼容，你可以使用以下命令运行SeekSoulTools，并指定所需版本的STAR的路径：

shell

seeksoultools rna run \
--fq1 /path/to/demo_dd/demo_dd_S39_L001_R1_001.fastq.gz \
--fq2 /path/to/demo_dd/demo_dd_S39_L001_R2_001.fastq.gz \
--samplename demo_dd \
--genomeDir /path/to/GRCh38/star \
--gtf /path/to/GRCh38/genes/genes.gtf \
--chemistry DDV2 \
--core 4 \
--include-introns \
--star_path /path/to/cellranger-5.0.0/lib/bin/STAR

NOTE

--star_path参数需与参考基因组索引版本严格对应，否则会导致比对失败。

示例3：一个样本有多组fastq数据

如果一个样本有多个FASTQ数据集，你可以在运行SeekSoulTools时提供与该样本相关的所有FASTQ文件的路径。以下是一个示例命令：

shell

seeksoultools rna run \
--fq1 /path/to/demo_dd_S39_L001_R1_001.fastq.gz \
--fq1 /path/to/demo_dd_S39_L002_R1_001.fastq.gz \
--fq2 /path/to/demo_dd_S39_L001_R2_001.fastq.gz \
--fq2 /path/to/demo_dd_S39_L002_R2_001.fastq.gz \
--samplename demo \
--genomeDir /path/to/GRCh38/star \
--gtf /path/to/GRCh38/genes/genes.gtf \
--chemistry DDV2 \
--core 4 \
--include-introns

示例4：自定义R1结构

要自定义 Read 1 (R1) FASTQ文件的结构，可以使用以下命令：

shell

seeksoultools rna run \
--fq1 /path/to/demo_dd_S39_L001_R1_001.fastq.gz \
--fq2 /path/to/demo_dd_S39_L001_R2_001.fastq.gz \
--samplename demo \
--genomeDir /path/to/GRCh38/star \
--gtf /path/to/GRCh38/genes/genes.gtf \
--barcode /path/to/utils/CLS1.txt \
--barcode /path/to/utils/CLS2.txt \
--barcode /path/to/utils/CLS3.txt \
--linker /path/to/utils/Linker1.txt \
--linker /path/to/utils/Linker2.txt \
--structure B9L12B9L13B9U8 \
--core 4 \
--include-introns

B9L12B9L13B9U8表示read1的结构为：9个碱基barcode+12个碱基linker+9个碱基barcode+13个碱基linker+9个碱基barcode+9碱基UMI，整体cellbarcode有3段，共27个碱基(9*3)，UMI为8个碱基
使用--barcode依次指定3段barcode，--linker依次指定2段linker。

TIP

自定义结构时，建议先用小样本测试结构参数，确保barcode/linker/UMI提取无误。

软件参数说明

参数	参数说明
--fq1	R1 fastq数据路径。
--fq2	R2 fastq数据路径。
--samplename	样本名称，会在outdir目录下创建以样本名称命名的目录。仅支持数字，字母和下划线。
--outdir	结果输出目录。默认值：./。
--genomeDir	STAR构建的参考基因组路径, 版本需要与SeekSoulTools使用的STAR一致。
--gtf	相应物种的gtf路径。
--core	分析使用的线程数。
--chemistry	试剂类型，每种对应一组`--shift`、`--pattern`、 `--structure`、`--barcode`和`--sc5p`的组合，可选值：DDV2，DD5V1，MM，MM-D； DDV2 对应SeekOne(R) DD单细胞3'转录组试剂盒； DD5V1 对应SeekOne(R) DD单细胞5'转录组试剂盒； MM 对应SeekOne(R) MM单细胞转录组试剂盒； MM-D 对应SeekOne(R) MM大孔径高通量转录组试剂盒
--skip_misB	barcode不允许碱基错配，默认允许一个碱基错配。
--skip_misL	linker不允许碱基错配，默认允许一个碱基错配。
--skip_multi	舍弃能纠错为多个白名单barocde的reads，默认纠错为比例最高的barcode。
--expectNum	预估的捕获细胞数目。
--forceCell	当正常分析得到的细胞数⽬不理想时，选⽤此参数，后⾯加⼀个预期的数值N，SeekSoulTools软件会按照UMI从⾼到低取前N个细胞。
--include-introns	不启用时，只会选择exon reads⽤于定量；启用时，intron reads也会⽤于定量。
--star_path	指定其他版本的STAR路径进行比对，版本需要与`--genomeDir`版本兼容，默认的`--star_path`为环境下的STAR。

WARNING

参数设置不当（如chemistry、genomeDir、gtf等）会直接导致分析失败或结果异常，请务必核对参数含义和输入路径。

结果文件说明

以下是输出目录结构：每一行代表一个文件或文件夹，用 "├──" 表示，数字表示三个重要的输出文件。

shell

./
├── demo_report.html                          1
├── demo_summary.csv                          2
├── demo_summary.json                    
├── step1                                
│   └──demo_2.fq.gz                      
├── step2                               
│   ├── featureCounts                   
│   │   └── demo_SortedByName.bam      
│   └── STAR                            
│       ├── demo_Log.final.out          
│       └── demo_SortedByCoordinate.bam  
├── step3
│   ├── filtered_feature_bc_matrix            3
│   └── raw_feature_bc_matrix          
└──step4                                
    ├── FeatureScatter.png              
    ├── FindAllMarkers.xls               
    ├── mito_quantile.xls               
    ├── nCount_quantile.xls             
    ├── nFeature_quantile.xls           
    ├── resolution.xls                   
    ├── top10_heatmap.png               
    ├── tsne.png                         
    ├── tsne_umi.png                    
    ├── tsne_umi.xls                     
    ├── umap.png                        
    └── VlnPlot.png

样本的html报告
样本的csv格式质控信息
算法判定是细胞的稀疏矩阵

NOTE

若输出目录缺失关键文件，请优先检查上游步骤是否报错，或参数设置是否正确。

处理过程

step1: barcode/UMI提取

SeekSoulTools根据不同的Read1的结构设计和参数对barcode/UMI进行提取和处理，对Read1和Read2进行过滤，输出新的fastq文件。

结构设计和描述

barcode和UMI描述以字母和数字描述Read1的基本结构，字母描述碱基含义，数字描述碱基长度。
B: barcode部分碱基
L: linker部分碱基
U: UMI部分碱基
X: 其他任意碱基，用于占位
以下面两种Read1结构为例:
B8L8B8L10B8U8：
B17U12：
错位设计的Anchor定位 MM设计下，为了增加Linker部分在测序时碱基均衡性，加入了1-4 bp的移码碱基，即anchor，anchor决定了barcode的起始位置。

数据流程

确定anchor：

对于Read1有错位设计的数据（MM试剂产出的数据），SeekSoulTools尝试在Read1序列前7个碱基中寻找anchor序列，以确定后续barcode等的起始。若没找到anchor序列，此条read以及对应的R2被认为是无效read。

Barcode和Linker矫正：

在确定barcode的起始后，根据结构设计，取出相应序列。当取出的barcode序列在白名单中时，我们认为它是有效barcode，计入有效barcode的reads数量；当barcode不在白名单中时，我们认为它是无效barcode。

测序过程中，有一定几率发生测序错误。在提供有白名单的情况下，SeekSoulTools可以尝试barcode矫正。在启用矫正时，当无效barcode一个碱基错配（一个hamming distance）的序列存在于白名单中：

只有唯一一个序列存在于白名单中：我们将这个无效barcode矫正为白名单中barcode；
有多个序列存在于白名单中：我们将这个无效barcode改为read支持数量最多的序列；

Linker的处理与Barcode相同。

接头和PolyA序列剪切

在转录组产品中，Read2的末端有可能会出现polyA tail，建库时可能引入的接头序列。我们对这些污染序列进行切除，剪切完的read2长度需要大于设定的最小长度来保证有足够的信息，准确比对到基因组的位置。如果剪切完成后的read2长度小于最小长度，我们认为这条read为无效read。

经过上述处理后，数据组成如下图：

step1

total: 总共的reads数目
valid: 不需要矫正和矫正成功的reads数目
B_corrected: 矫正成功的reads数目
B_no_correction: 错误Barcode的reads数目
L_no_correction: 错误Linker的reads数目
no_anchor：不包含anchor的reads数目
trimmed: 进行过剪切的reads数目
too_short: 进行过剪切后长度小于60bp的reads数目

指标之间的关系如下：

total = valid + no_anchor + B_no_correction + L_no_correction

输出fastq的reads数：total_output = valid - too_short

step2: 进行比对并找到比对基因

序列比对

使用STAR比对软件将处理后的R2比对到参考基因组上。
使用QualiMap软件和转录本注释文件GTF，统计reads比对外显子、内含子和基因间区等的比例。
使用featureCounts将比对上的read注释到基因上，可以选择不同的注释规则，如链方向性和定量的feature。当使用外显子定量时，当read超过50%碱基比对到外显子区域时，认为该read来源于此外显子以及外显子对应的基因；当使用转录本定量时，当read超过50%碱基比对到转录本区域时，认为该read来源于此转录本以及转录本对应的基因。

经过上述处理后，有如下数据指标：

Reads Mapped to Genome: 比对到参考基因组上的reads占所有reads的比例（包括只有一个比对位置和多个比对位置的reads）
Reads Mapped Confidently to Genome: 在参考基因组上只有一个比对位置的reads占所有reads的比例
Reads Mapped to Intergenic Regions：比对到基因间隔区reads占所有reads的比例
Reads Mapped to Intronic Regions：比对到内含子reads占所有reads的比例
Reads Mapped to Exonic Regions：比对到外显子reads占所有reads的比例

step3: 定量

UMI定量

SeekSoulTools以barcode为单位提取featureCounts输出的bam数据，统计注释到基因的UMI和UMI对应的reads数：

过滤掉对应UMI为单个重复碱基的reads，例如UMI为TTTTTTTT
当read注释到多个基因，在有唯一外显子的注释时，为有效read，其他情形下都过滤掉

UMI矫正

测序过程中，UMI也有一定概几率出现测序错误。SeekSoulTools默认使用UMI-tools的adjacency方法对UMI进行矫正。

Schematic from UMI-tools 图片来源: https://umi-tools.readthedocs.io/en/latest/the_methods.html

细胞判定

在一个细胞群中，我们认为细胞和细胞的mRNA的含量不会相差太多。如果一个barcode对应的mRNA的含量很低，我们认为这个barcode的磁珠并没有捕获细胞，mRNA来源于背景。SeekSoulTools会以上面的规则，进行barcode是否为细胞的判定。有以下几个步骤：

对所有barcode按照对应的UMI数由高到低排序；
取预估细胞的1%位置的barcode的UMI数除以10为阈值；
barcode的UMI数大于阈值的判定为细胞；
barocde的UMI小于阈值，但大于300时，使用DropletUtils分析。DropletUtils方法先假设UMI数量低于100的barcode为empty droplet，然后根据每个droplet相同基因的UMI数总和为背景RNA表达谱中该基因UMI数目，进而得到基因UMI数目的期望值。再通过将每个barcode的UMI数进行统计学检验，显著差异的为细胞；
不符合上述条件的为背景。

经过上述处理后，有如下数据指标：

Estimated Number of Cells: 算法判定的细胞总数
Fraction Reads in Cells: 判定为细胞的reads占所有参与定量的reads的比例
Mean Reads per Cell: 细胞的平均reads数，总reads数/判定的细胞数
Median Genes per Cell: 判定为细胞的barcode中基因数的中位数
Median UMI Counts per Cell: 判定为细胞的barcode中UMI数的中位数
Total Genes Detected: 所有细胞检测到基因数量
Sequencing Saturation: 饱和度，1 - UMI总数/reads总数

step4: 后续分析

经过上述定量，得到表达矩阵后，我们可以进行下一步的分析。

Seurat分析流程

使用Seurat计算线粒体含量，细胞中UMI总数，细胞中基因总数。之后对矩阵进行归一化、寻找高变基因、降维聚类之后寻找差异基因。

fast模块参考fast模块

vdj模块

数据准备

测试数据下载

测试数据 - md5: afbd2deac59b581a4d44a0f73655d71d（物种：人）

shell

wget -c -O PBMC_xin.tar "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/demodata/PBMC_xin.tar"
# decompress
tar xf PBMC.tar

shell

curl -C - -o PBMC_xin.tar "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/demodata/PBMC_xin.tar"
# decompress
tar xf PBMC.tar

运行

运行示例

示例1：T细胞受体分析示例

shell

seeksoultools vdj run \
--fq1 /path/to/demo_tcr/demo_tcr_R1.fq.gz \
--fq2 /path/to/demo_tcr/demo_tcr_R2.fq.gz \
--chemistry DD5V1 \
--samplename demo_tcr \
--chain TR \
--core 16  \
--outdir /path/to/ouput/demo_tcr \
--organism human

示例2：B细胞受体分析示例

shell

seeksoultools vdj run \
--fq1 /path/to/demo_bcr/demo_bcr_R1.fq.gz \
--fq2 /path/to/demo_bcr/demo_bcr_R2.fq.gz \
--chemistry DD5V1 \
--samplename demo_bcr \
--chain IG \
--core 16  \
--outdir /path/to/ouput/demo_bcr \
--organism human

软件参数说明

参数	参数说明
--fq1	R1 fastq数据路径。
--fq2	R2 fastq数据路径。
--samplename	样本名称。仅支持数字，字母和下划线。
--chemistry	试剂类型，每种对应一组`--shift`、`--pattern`、 `--structure`、`--barcode`和`--sc5p`的组合，可选值：DD5V1； DD5V1 对应SeekOne(R) DD单细胞5'转录组试剂盒。
--organism	物种，可选值：human，mouse， monkey，rabbit，rat。
--chain	链类型，可选值：IG，TR； IG对应B细胞受体； TR对应T细胞受体。
--core	分析使用的线程数。
--outdir	结果输出目录，绝对路径，并且保证每个任务的outdir唯一。
--skip_misB	barcode不允许碱基错配，默认允许一个碱基错配。
--skip_misL	linker不允许碱基错配，默认允许一个碱基错配。
--skip_multi	舍弃能纠错为多个白名单barocde的reads，默认纠错为比例最高的barcode。

结果文件说明

以下是输出目录结构：每一行代表一个文件或文件夹，用 "├──" 表示。

shell

outs/
├── airr_rearrangement.csv             airr格式的结果文件
├── all_contig_annotations.csv         组装得到的所有contig的注释结果文件
├── all_contig.fasta                   组装得到的所有contig的fasta格式序列文件
├── clonotypes.csv                     clonotype相关文件
├── consensus_annotations.csv          以克隆型的链为单位得到一致性序列的注释结果文件
├── consensus.fasta                    以克隆型的链为单位得到一致性序列的fasta格式文件
├── filtered_contig_annotations.csv    过滤后的contig的注释结果文件
├── filtered_contig_igblast.fasta      过滤后的contig的fasta格式序列文件
├── metrics_summary.csv                质控指标相关的总结文件
└── report.html                        报告文件

处理过程

barcode/UMI提取

SeekSoulTools根据Read1的结构设计和参数对barcode/UMI进行提取和处理，对Read1和Read2进行过滤，输出新的fastq文件。

结构设计和描述

barcode和UMI描述以字母和数字描述Read1的基本结构，字母描述碱基含义，数字描述碱基长度。
B: barcode部分碱基
U: UMI部分碱基
X: 其他任意碱基，用于占位

免疫分析产品的Read1结构为B17U12：

数据流程

Barcode识别和矫正:

根据结构设计，确定barcode所在序列位置，取出相应序列。当取出的barcode序列在白名单中时，我们认为它是有效barcode，计入有效barcode的reads数量；当barcode不在白名单中时，我们认为它是无效barcode。

只有唯一一个序列存在于白名单中：我们将这个无效barcode矫正为白名单中barcode；
有多个序列存在于白名单中：我们将这个无效barcode改为read支持数量最多的序列；

接头和PolyA序列剪切:

在建库时可能引入的接头或者TSO等序列，我们对这些污染序列进行切除，剪切完的read1和read2长度需要大于设定的最小长度来保证有足够的信息，准确比对到基因组的位置。如果剪切完成后的read1或read2长度小于最小长度，我们认为这条read为无效read。

经过上述处理后，数据指标包括：

total: 总共的reads数目
valid: 不需要矫正和矫正成功的reads数目
B_corrected: 矫正成功的reads数目
B_no_correction: 错误Barcode的reads数目
trimmed: 进行过剪切的reads数目
too_short: 进行过剪切后长度小于60bp的reads数目

输出fastq的reads数：total_output = valid - too_short

序列组装

vdj序列组装指的是将测序reads装成为长的vdj序列，主要包含以下步骤（示意图如上）：

将reads比对到参考序列，获得相对于参考序列的坐标。
首先，将read和VDJ的germline参考序列分别切成11bp的kmer，然后计算read和参考序列间共有的kmer数目，作为read与参考序列比对长度。接着，如果read和参考序列之间有22bp的碱基是完全匹配的，就认为该read可以比对到参考序列上。对于上述得到的可以比对到germline参考序列的一条read，我们根据比对长度，确认其参考序列是V-REGION，J-REGION或者C-REGION中的哪一种。一条read可以比对到V-REGION（J-REGION或者C-REGION）的多个基因。我们将同一barcode和同一umi的所有reads比对到最多的V-REGION（J-REGION或者C-REGION）的基因，作为最终的参考序列。最后，根据该参考序列，将read上的每个碱基，标记上相对于参考序列的坐标。
对具有相同参考序列坐标的reads上的碱基进行纠错。
分别计算对应于参考序列每个位置上的reads碱基的一致性。如果reads的覆盖深度大于或等于2，并且碱基的一致率大于或等于51%，则选取出现次数最多的碱基；反之则标记为N。
纠错后的reads，组装成长的consensus contig。
使用相对于V-REGION，J-REGION或者C-REGION的坐标，将reads之间进行连接，组装成长的consensus contig。组装consensus contig的方法有两种（默认为使用第二种方式）：第一种，使用具有同一umi的reads进行组装，每个umi得到一个V-REGION，J-REGION或者C-REGION的contig；第二种，将同一V-REGION（J-REGION或者C-REGION）基因的所有reads进行合并，分别得到一个V-REGION，J-REGION或者C-REGION的contig。
V-REGION，J-REGION和C-REGION的consensus contig之间的组装。
V-REGION，J-REGION和C-REGION的consensus contig之间通过overlap进行连接，形成完整的序列。将相互之间具有18 bp以上overlap的contig，进行连接。

组装序列过滤

根据组装指标进行过滤：
对于在barcode中同时存在轻链和重链的contig，则符合以下条件之一的contig会被丢掉：对于BCR，如果contig的umi小于3；对于TCR则不做该过滤。
理论上，在一个样本中，与同一种重链所匹配的轻链数量是有限的。而如果存在污染，则会出现一种重链对应很多种轻链的情况。对于umi小于或者等于10的contig，如果符合两个条件之一，会被过滤掉：条件1，在所有barcode中，与重链配对的轻链类型小于10种，并且平均umi数目小于或者等于5，则该轻链及其配对的重链类型。条件2，如果与重链配对的轻链大于10种，并且占比小于50%的轻链及其配对的重链类型。
对于在barcode中仅存在轻链或者重链的contig，则符合以下条件之一的contig会被丢掉：对于BCR，如果contig的umi小于3；对于TCR则不做该过滤。
contig所在的barcode的总reads数目小于或者等于50，则该barcode中的所有contig均丢掉。
对于在多个barcode中出现，并且在超过75%的barcode中都只包含轻链或者重链的，同时umi小于5或者reads小于所有barcodereads数中值1/2的contig。
根据注释结果进行过滤：
根据igblast的结果，仅保留序列全长大于或等于300 bp，并且complete_vdj和productive均为TRUE的contig。
对一个barcode有过多的contig的进行过滤：对于每个细胞/barcode中chain（例如TRA或者TRB）来讲，最多保留两个序列。如果超出两个，则仅保留出现次数最多的两个CDR3核酸序列对应的组装序列。如果每个CDR3核酸对应多个组装序列，则选取umis和reads数目最多的组装序列。

VDJ注释

注释使用igblast软件，详细请参考https://ncbi.github.io/igblast/。

参考序列下载子IMGT网站（http://www.imgt.org），包含人，猴，小鼠，大鼠和兔等五个物种。

细胞鉴定

经组装序列过滤后，包含一个及以上contig的barcode，判定为细胞。

clonotype计算

clonotype计算使用changeo，详细请参考https://changeo.readthedocs.io/en/stable/。

utils模块

addtag

对bam进行修改，添加barcode和umi标签。

运行示例

为分析设置必要的配置文件，包括样本的bam文件和step3目录下的umi.xls文件。使用以下命令运行SeekSoulTools：

shell

seeksoultools utils addtag \
    --inbam step2/featureCounts/Samplename_SortedByName.bam \
    --umifile step3/umi.xls \
    --outbam Samplename_addtag.bam

软件参数说明

参数	参数说明
--inbam	输入的bam,step2 featureCount目录下的bam文件。
--outbam	addtag之后的bam文件名称
--umifile	输入的umi文件，seeksoultools输出目录step3的umi.xls文件

常见问题

如何构建参考基因组？

参考基因组的构建请参考如何构建参考基因组？。

如何选择chemistry？

chemistry参数的设定跟所用试剂类型相关，比如全序列和FFPE产品选择DD-Q，DD单细胞3'转录组试剂盒请选择DD—V2， DD单细胞5'转录组试剂盒选择DD5V1等。如果chemistry参数选择错误可直接在log日志中查找"valid barcode rate of"相关信息，后面的比例太低则表示chemistry不正确。或者在samplename_summary.json文件中可查看valid 和total的比例。

为什么出现FASTQ相关报错？

软件报错"Error while decompressing extra concatenatedgzip files on *fastq.gz\n"? 根据提示，输出的fq文件应该是不完成的，请核对参数–fq1 --fq2参数的文件是否完整。同样是fq数据不完整，也可能出现如下错误信息"FileFormatError: Error in sequence file at unknown line: Reads are improperly paired. There are more reads in file 1 than in file 2." 或者"Error in FASTQ file at line 4: Premature end of file encountered. The incomplete final record was: '@A01565:134:HKFGNDSX3:1:1101:11080:2957 1:N:0:CACTTCGA+ACAGCTGC\nCCATCACTACGGAAGGTTGAGCTCTATGATTTTTT…ATTATTATT\n+\n' err!!!",总而言之，请一定确保自己的fq文件是完整且配对的。

为什么没有barcodes.tsv.gz文件？

软件报错"No such file or directory: '/outputpath/samplename/step3/filtered_feature_bc_matrix/barcodes.tsv.gz'" ? 首先查看输出目录，如果有raw_feature_bc_matrix,并且该目录下的三个文件大小没有异常小，此时可以单独运行一个细胞判定的脚本Rscript /path/seeksoultools/lib/python3.XX/site-packages/seeksoultools/utils/cell_identify.R -i outputpath/step3/raw_feature_bc_matrix -e 3000（该命令在日志中有输出） ,当执行此脚本时应该会出现报错信息，比如缺少某个R包的问题，此时请确认，1.2.1版本之前的，在脚本执行的时候先激活环境，比如请执行 source activate seeksoultools，或者export PATH=/path/seeksoultools/bin:$PATH，激活环境后重新运行脚本。另外温馨提示，在安装seeksoultools软件时不要把它软链到另一个磁盘等，请直接安装，并且保证环境名称是唯一的，在运行脚本的时候使用绝对路径。

如果检查输出目录中raw_feature_bc_matrix目录下的文件大小异常小，比如只有几个字节大小，此时可能是gtf文件有问题。具体的gtf格式说明及要求，可以参考如何构建参考基因组？。

为什么出现samtools报错？

软件报错"stderr: samtools sort: failed to read header from '/outputpath/samplename/.test/test_1M_Aligned.out.bam'"? 根据提示bam文件有问题，此时请查看/outputpath/samplename/.test/test_1M_Log.out。文件可能会提示'FATAL INPUT ERROR: unrecognized parameter name "genomeType" in input "genomeParameters.txt"',或者'EXITING because of FATAL ERROR: Genome version: 2.7.1a is INCOMPATIBLE with running STAR version: 2.7.10a SOLUTION: please re-generate genome from scratch with running version of STAR, or with version: 2.7.4a'也会提示索引的版本和STAR软件的版本。报错原因是二者版本不一致，请给软件传递参数–star_path 给定构建索引用的STAR软件路径。

用1.2.2版本seeksoultools分析完数据得到的web sumarry中线粒体比例都是0？ seeksoultools是根据gtf中gene_name的value中是否以Mt- 或者mt- 开头来判断线粒体基因的，如果gtf中gene_name的value没有进行这种修改就会导致报告中mt比例均为0.

为什么没有rnaseq_qc_results.txt？

软件报错"No such file or directory: '/outputpath/samplename/step2/STAR/rnaseq_qc_results.txt'" 根据提示，软件在qualimap步骤运行失败，对于1.2.1及其之前的版本，需要在下载完软件包之后进行unpack。具体操作方式为："source ./bin/activate ; ./bin/conda-unpack"

为什么出现biotype的问题？

软件运行报错"gene_biotype = re.search(r'(gene_type|gene_biotype|transcript_biotype|transcript_type) "(.*?)";', ids).group(2) AttributeError: 'NoneType' object has no attribute 'group'" 在1.2.1及其之前版本fast模块要求gtf文件的attribute列中有记录gene的biotype，当出现这个提示的时候，可以修改gtf文件，确保gene有biotype，或者可以用1.2.2及其之后的版本，当读取不到基因的biotype是，默认type为"undefine"。

关注的某个基因，最后矩阵中为什么表达量都是0？

在进行定量的时候，如果某条reads即比对到A基因又比对到B基因，在1.2.0之前的版本是直接丢掉，1.2.0及其之后的版本会对基因的位置做进一步判定，如果只有某个基因比对到的是exon区间，其他基因比对的是非exon区间，则将该reads判定给该基因。进行排查时，首先从step2/featureCounts/*_SortedByName.bam里面提取出'XT'tag中包含该基因（ensemble id 而非symbol）的reads，然后针对这些reads逐条检查，是不是XTtag中包含的多个基因，且目标基因比对的区域非exon或者XTtag包含的基因中有多个是比对的exon区域。

发布说明

v1.2.2

添加vdj分析模块
fast模块对FFPE样本的支持
修复gtf中没有lncRNA类型引起基因中位数的统计错误
解决基因名称重复导致差异基因缺失EnsemblID的问题
其他改进，提升易用性

v1.2.1

更新报告样式
增加SP1、SP2和TSO和接头的剪切
增加对bam添加addtag的工具
增强对非标准gtf的支持
fast模块支持人和鼠之外的物种

v1.2.0

增加去除barcode和umi序列后的read1的fq文件输出
添加fast分析模块
应用UMI-tools的矫正方法
更新read注释到多个基因时的处理规则：在有唯一外显子的注释时，视为有效read

v1.0.0

首次发布

SeekSoulTools

数据集

SeekSoulTools

数据集

SeekSoul Tools v1.2.2 ​

软件下载 ​

软件安装 ​

安装： ​

使用说明 ​

rna模块 ​

数据准备 ​

测试数据下载 ​

参考基因组下载和构建 ​

运行 ​

运行示例 ​

软件参数说明 ​

结果文件说明 ​

处理过程 ​

step1: barcode/UMI提取 ​

结构设计和描述 ​

数据流程 ​

接头和PolyA序列剪切 ​

step2: 进行比对并找到比对基因 ​

序列比对 ​

step3: 定量 ​

UMI定量 ​

UMI矫正 ​

细胞判定 ​

step4: 后续分析 ​

Seurat分析流程 ​

fast模块参考fast模块 ​

vdj模块 ​

数据准备 ​

测试数据下载 ​

运行 ​

运行示例 ​

软件参数说明 ​

结果文件说明 ​

处理过程 ​

barcode/UMI提取 ​

结构设计和描述 ​

数据流程 ​

序列组装 ​

组装序列过滤 ​

VDJ注释 ​

细胞鉴定 ​

clonotype计算 ​

utils模块 ​

addtag ​

运行示例 ​

软件参数说明 ​

常见问题 ​

如何构建参考基因组？ ​

如何选择chemistry？ ​

为什么出现FASTQ相关报错？ ​

为什么没有barcodes.tsv.gz文件？ ​

为什么出现samtools报错？ ​

为什么没有rnaseq_qc_results.txt？ ​

为什么出现biotype的问题？ ​

关注的某个基因，最后矩阵中为什么表达量都是0？ ​

发布说明 ​

v1.2.2 ​

v1.2.1 ​

v1.2.0 ​

v1.0.0 ​

SeekSoul Tools v1.2.2

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rna模块

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参考基因组下载和构建

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处理过程

step1: barcode/UMI提取

结构设计和描述

数据流程

接头和PolyA序列剪切

step2: 进行比对并找到比对基因

序列比对

step3: 定量

UMI定量

UMI矫正

细胞判定

step4: 后续分析

Seurat分析流程

fast模块参考fast模块

vdj模块

数据准备

测试数据下载

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处理过程

barcode/UMI提取

结构设计和描述

数据流程

序列组装

组装序列过滤

VDJ注释

细胞鉴定

clonotype计算

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如何构建参考基因组？

如何选择chemistry？

为什么出现FASTQ相关报错？

为什么没有barcodes.tsv.gz文件？

为什么出现samtools报错？

为什么没有rnaseq_qc_results.txt？

为什么出现biotype的问题？

关注的某个基因，最后矩阵中为什么表达量都是0？

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